黨堅持團結(jié)反對分裂、堅持進步反對倒退，同國民黨頑固派的反共活動進行了堅決斗爭。1939年冬至1940年春，國民黨頑固派掀起第一次反共高潮，黨給予堅決回擊。1941年初，國民黨頑固派制造震驚中外的皖南事變。新四軍軍部及所屬部隊9000余人，在向北轉(zhuǎn)移途中遭到國民黨軍8萬余人圍攻，除約2000余人突圍外，一部被打散，大部壯烈犧牲或被捕，軍長葉挺在同國民黨軍進行戰(zhàn)場談判時被扣押，副軍長項英遇害。事變發(fā)生后，蔣介石竟誣稱新四軍“叛變”，宣布取消其番號。
面對國民黨頑固派掀起的又一次反共高潮，共產(chǎn)黨采取軍事上嚴守自衛(wèi)、政治上堅決反擊的方針。中共中央軍委宣布重建新四軍軍部，任命陳毅為代軍長，劉少奇為政治委員。毛澤東揭露國民黨頑固派破壞抗戰(zhàn)的陰謀，提出懲辦禍首、釋放葉挺、廢除國民黨一黨專政、實行民主政治等十二條解決辦法。周恩來在重慶向國民黨當局提出嚴重抗議，并親筆題詞“為江南死國難者志哀”和“千古奇冤，江南一葉；同室操戈，相煎何急?!”這兩條充滿悲憤的題詞在《新華日報》登出，有力地揭露和聲討了國民黨頑固派的反動行徑。
全國人民及國際輿論普遍同情共產(chǎn)黨，譴責國民黨當局消滅異己、破壞抗戰(zhàn)。國民黨頑固派陷于極端孤立的境地，其反共活動不得不有所收斂。黨以大局為重的正確措置，使極度危急的國內(nèi)時局得以扭轉(zhuǎn)，黨在全國的政治地位空前提高。
黨深刻地總結(jié)同國民黨頑固派斗爭的經(jīng)驗，豐富和發(fā)展了統(tǒng)一戰(zhàn)線的策略。這主要是:在抗日民族統(tǒng)一戰(zhàn)線中要采取“發(fā)展進步勢力，爭取中間勢力，孤立頑固勢力”的總方針，在反對國民黨頑固派的斗爭中要堅持“人不犯我，我不犯人，人若犯我，我必犯人”的自衛(wèi)立場和“有理、有利、有節(jié)”的原則。這些策略原則使黨得以在復(fù)雜多變的環(huán)境里更加熟練而恰當?shù)靥幚斫y(tǒng)一戰(zhàn)線中的各種棘手問題，避免犯“左”、右傾錯誤。
在此期間，針對國民黨大肆鼓吹“共產(chǎn)主義不適合中國國情”等反共謬論，黨在政治思想戰(zhàn)線上同國民黨展開論戰(zhàn)，批判和揭露各種假三民主義，著重闡述三民主義與共產(chǎn)主義的關(guān)系，說明共產(chǎn)主義的最低綱領(lǐng)和新三民主義基本相同，但兩者又有區(qū)別，共產(chǎn)黨將同一切真誠的三民主義者長期合作。這場論戰(zhàn)對新民主主義理論體系的形成起了推動作用。
為了駁斥國民黨頑固派的反共宣傳，向全黨和全國人民闡明共產(chǎn)黨對于中國革命及其前途的全部見解，回答中國向何處去這個關(guān)系重大的問題，更好地指導(dǎo)抗戰(zhàn)和中國革命，毛澤東進行了大量的理論研究工作。他系統(tǒng)總結(jié)中國革命的獨創(chuàng)性經(jīng)驗，于1939年底1940年初先后發(fā)表《<共產(chǎn)黨人>發(fā)刊詞》、《中國革命和中國共產(chǎn)黨》、《新民主主義論》等著作，完整地闡述了新民主主義理論。
毛澤東指出，半殖民地半封建社會的性質(zhì)，決定了中國革命必須分成兩步走，第一步進行民主主義革命，第二步進行社會主義革命。中國民主革命在五四運動以后已經(jīng)不是資產(chǎn)階級領(lǐng)導(dǎo)的民主革命，而是新民主主義的革命。新民主主義革命是無產(chǎn)階級領(lǐng)導(dǎo)的人民大眾的反帝反封建的革命。區(qū)別新舊民主主義革命性質(zhì)的根本標志是無產(chǎn)階級領(lǐng)導(dǎo)權(quán)問題。
新民主主義革命的基本綱領(lǐng)是:政治上，推翻帝國主義和封建主義的壓迫，在中國建立一個以無產(chǎn)階級為領(lǐng)導(dǎo)的、以工農(nóng)聯(lián)盟為基礎(chǔ)的各革命階級聯(lián)合專政的民主共和國。經(jīng)濟上，沒收操縱國計民生的大銀行、大工業(yè)、大商業(yè)，建立國營經(jīng)濟；沒收地主土地歸農(nóng)民所有，并引導(dǎo)農(nóng)民發(fā)展合作經(jīng)濟；允許民族資本主義經(jīng)濟的發(fā)展和富農(nóng)經(jīng)濟的存在。文化上，廢除封建買辦文化，發(fā)展民族的科學的大眾的文化。
新民主主義的發(fā)展前途，必然是社會主義。新民主主義革命和社會主義革命是兩個不同的革命階段，不能畢其功于一役，但兩個革命階段必須也必然是相互連接的，不容橫插一個資產(chǎn)階級專政。實現(xiàn)黨在民主革命階段的最低綱領(lǐng)，也是為著將來實現(xiàn)最高綱領(lǐng)。新民主主義革命是以共產(chǎn)主義思想為指導(dǎo)的。
統(tǒng)一戰(zhàn)線，武裝斗爭，黨的建設(shè)，這是中國共產(chǎn)黨在中國革命中戰(zhàn)勝敵人的三個主要法寶。“統(tǒng)一戰(zhàn)線和武裝斗爭，是戰(zhàn)勝敵人的兩個基本武器。統(tǒng)一戰(zhàn)線，是實行武裝斗爭的統(tǒng)一戰(zhàn)線。而黨的組織，則是掌握統(tǒng)一戰(zhàn)線和武裝斗爭這兩個武器以實行對敵沖鋒陷陣的英勇戰(zhàn)士。”
以毛澤東為主要代表的中國共產(chǎn)黨人創(chuàng)立的新民主主義理論，是馬克思列寧主義同中國革命實際相結(jié)合的產(chǎn)物，是中國革命特別是建黨以來歷史經(jīng)驗的全面總結(jié)，是毛澤東思想在抗戰(zhàn)時期最重大的理論成果。它的提出，使全黨和全國人民對中國新民主主義革命的性質(zhì)、內(nèi)容、領(lǐng)導(dǎo)權(quán)和發(fā)展前途等有了明確而完整的認識，對中國革命的勝利發(fā)展具有重大的指導(dǎo)作用。